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Comment calculer la Concentration en anticorps

Comment calculer la Concentration en anticorps


Une des méthodes plus courantes du calcul d'une concentration de la protéine dans un environnement de laboratoire consiste à utiliser une analyse de Bradford. Le réactif de Bradford est un réactif colorimétrique qui change de couleur basée sur la concentration de protéines. En combinant une courbe standard connue avec le réactif de Bradford, vous pouvez créer une mesure contre laquelle vous pouvez calculer la concentration d'une protéine, y compris les anticorps.

Instructions

Créer une norme

• Mesurer 200 mg de BSA sur papier à l'aide d'une échelle de laboratoire de pesage. Mettez-le dans un tube de microcentrifuge. Ajouter 2ml de tampon dans le tube de microcentrifuge contenant 200 mg de BSA. Label ce tube « 1 ».

• Tube vortex 1 jusqu'à dissolution complète de la BSA.

• Retirer 500 ul de la BSA dans un tampon et le transférer dans un deuxième tube. Label ce tube « 2. » Ajouter 500 ul de tampons lisses à Tube 2.

• Retirer 200 ul de BSA dans un tampon de Tube 1 et transférez-le dans un nouveau tube. Label ce tube « 3 ». Ajouter 800 ul de tampons lisses à Tube 3.

• Retirer 100 ul de BSA dans un tampon de Tube 1 et transférez-le dans un nouveau tube. Label ce tube « 4. » Ajouter 900 ul de tampons lisses à Tube 4.

• Retirer 10 ul de BSA dans un tampon de Tube 1 et transférez-le dans un nouveau tube. Label ce tube « 5. » Ajouter 990 ul de tampons lisses à Tube 5. Tubes de 1 à 5 composent une série graduée de standard. Le premier tube a une concentration de 100 mg/ml ; le deuxième, 50 mg/ml ; la troisième, 20 mg/ml, le quatrième, 10 mg/ml ; et le cinquième, 1 mg/ml. Chaque tube contient environ 1ml de solution.

Créer des Dilutions d'anticorps

• Ajouter 5 0ul anticorps purifié à 95 0ul de mémoire tampon. Label ce tube « A. »

• Ajouter 10 ul des anticorps purifiés à 990 ul de mémoire tampon. Label ce tube « b ».

• Ajouter 2 ul des anticorps purifiés à ul 998 du tampon. Label ce tube « C. »

La plaque de charge

• Placer 0,5 ml de tampon ordinaire dans les premier puits dans deux colonnes de la plaque multipuite.

• Verser 0,5 ml du contenu du Tube 1 dans les deuxième puits des deux premières colonnes de la plaque multipuite. Continuez vers le bas de la série graduée jusqu'à ce que les deux premières colonnes contiennent 0,5 ml d'une solution titrée de BSA de chacun des Tubes 1-5, y compris les puits pour tampon plaine.

• Ajouter 0,5 ml de réactif de Bradford dans chaque puits. Agiter la plaque pour mélanger le réactif avec les solutions protéiques, en veillant à ne pas renverser le contenu de le quelconque des puits. Attendre 5 minutes.

• Lisez la plaque selon le protocole spécifique à votre lecteur de plaque à une longueur d'onde de 595 nm.

Calculer la Concentration en anticorps

• Copie les valeurs lues à partir du lecteur de plaque dans Microsoft Excel.

• Créer un graphique des deux colonnes des valeurs qui représentent la norme de BSA à l'aide de l'Assistant graphique dans Microsoft Excel.

• Tracer les points mesurés à partir des dilutions d'anticorps dans le graphique d'Excel. Lire la concentration des protéines selon la valeur de l'axe y pour le point de dilution des anticorps sur le graphique Excel.

• Selon si vous utilisez les valeurs obtenues par Tube A, B ou C, multiplier la valeur de 20, 40 ou 500, respectivement. La valeur résultante est la concentration de vos anticorps purifiés.